（慶応元年５月時点）

　　　　　　　　　　

　　　　　　局長　　　　　　近藤勇
　　　副長　　　　　　土方歳三
　　　参謀　　　　　　伊藤甲子太郎
　　　組長一番　　　　沖田総司
　　　組長二番　　　　永倉新八
　　　組長三番　　　　斎藤　一
　　　組長四番　 　　 松原忠司
　　　組長五番　　　　武田観柳斎
　　　組長六番　　　　井上源三郎
　　　組長七番　 　　 谷三十郎
　　　組長八番　　　　藤堂平助
　　　組長九番　 　　 鈴木三樹三郎
　　　組長十番　　　　原田左之助
　　　諸士取調役観察　山崎　丞
　　　　　　　　　　　篠原泰之進
　　　　　　　　　　　新井忠雄
　　　　　　　　　　　服部武雄
　　　　　　　　　　　芦屋　昇　
　　　　　　　　　　　吉村貫一郎
　　　　　　　　　　　尾形俊太郎
　　　　撃剣師範　　　沖田総司
　　 　　　　　　　 　池田小三郎
　　 　　　　　　　　 永倉新八
　　　 　　　　　　　 田中寅三
　　　 　　　　　　　 新井忠雄
　　　 　　　　　　　 吉村貫一郎
　　　 　　　　　　　 斎藤　一
　　　　柔術師範　　　篠原泰之進
　　　　　　　　　　　柳田三次郎
　　　 　　　　　　　 松原忠司
　　　　文学師範　　　伊藤甲子太郎
　　　 　　　　　　　 武田観柳斎
　　　 　　　　　　　 司馬良作
　　　　 　　　　　　 尾形俊太郎
　　　 　　　　　　　 毛内有之助
　　　　砲術師範　　　清原　清
　　　 　　　　　　　 阿部十郎
　　　　馬術師範　　　安富才助
　　　　槍術師範　　　谷三十郎

十番までの組の下には十人の平隊士がいたが、五人を一組として伍長が置かれた。
土方は、フランス式の中隊ユニットを参考にした。