本研究では、インゲンマメのマメゾウムシ類生育阻害物質について、遺伝性を解明するとともに生化学的機能を解析し、虫害抵抗性の育種素材としての可能性を探った。まず、インゲンマメ種子に含まれるタンパク質性の生育阻害物質、α−アミラーゼインヒビター(αＡＩ)とアルセリン（arcelin)の変異について、遺伝様式と相互の遺伝的関係を明らかにした。次に、これらの中で有用な生育阻害物質として考えられたαＡＩ−２とαＡＩ−３のタンパク質構造と機能を解析した。さらに、αＡＩ−２については、遺伝子をクローニングし、本遺伝子を用いた抵抗性品種の育成法について考察した。得られた知見は以下の通りである。

１．インゲンマメ種子のαＡＩは、ブタすい臓のα−アミラーゼ活性を阻害するαＡＩ−１(a, b, c, d)、ブラジルマメゾウムシ幼虫のα−アミラーゼ活性を阻害するαＡＩ−２、これら２種類のα−アミラーゼ活性を阻害するαＡＩ−３に分類される。αＡＩ−０(a, b)は、α−アミラーゼ活性に阻害性を示さない欠失型である。本研究における交配試験の結果、αＡＩの各変異は、優性の１遺伝子、Ai１（ａ，ｂ，ｃ，ｄ）、Ai２、Ai３、に支配されること、また、欠失型のαＡＩ−０(a, b)は、1劣性遺伝子(ai)支配を受けることを明らかにした。アルセリンは、６種類の変異が確認されている。本研究では、これらが優性の１遺伝子に支配され、アルセリン３、４、６がαＡＩ−２と、また、アルセリン１、２、５がαＡＩ欠失と遺伝的に強連鎖していることを明らかにした。すでに、アルセリン１、２、３、４がインゲンマメのレクチンであるＰＨＡ(phytohemagglutinin)と、また、αＡＩ−１がＰＨＡと、それぞれ遺伝的に強連鎖関係にあることが報告されている。ＰＨＡは、血球凝集作用を示すレクチンタンパク質で、哺乳類、鳥類に対して毒性を示す。それ故、αＡＩ、アルセリン、ＰＨＡは、連鎖して遺伝することで、単独または共同してインゲンマメの防御機構を担っているものと考えられた。

２．ブラジルマメゾウムシ抵抗性のインゲンマメ系統からαＡＩ−２を精製した。タンパク質構造を分析した結果、αＡＩ−２は、２種類の異なるサブユニットからなるヘテロ４量体で、ほぼαＡＩ−１と同様な３次元構造であると考えられた。αＡＩ−２のα−アミラーゼ活性に対する阻害性を調査した結果、αＡＩ−２は、ブラジルマメゾウムシ幼虫のα−アミラーゼ活性を強く阻害し、アズキゾウムシ幼虫に対しては弱い阻害性を示した。しかしながら、哺乳類のブタすい臓の活性は全く阻害しなかった。αＡＩ−１は、ブタとアズキゾウムシ幼虫のα−アミラーゼ活性を強く阻害したが、ブラジルマメゾウムシ幼虫の活性を阻害しないことから、αＡＩ−１とαＡＩ−２は全く異なるα−アミラーゼ活性阻害性を有することが明らかになった。人工豆を用いたマメゾウムシ類の飼育試験において、αＡＩ−２は、1.0％濃度でブラジルマメゾウムシに、0.3%濃度でアズキゾウムシに生育阻害性を示したが、αＡＩ−１は、後者のみに0.3%濃度で阻害性を示した。ブラジルマメゾウムシ抵抗性のインゲンマメ系統は、αＡＩ−２を0.4−0.5％含んでいる。αＡＩ−２をこの濃度で混入させた人工豆において、ブラジルマメゾウムシの生育は、強くは阻害されなかった。このため、αＡＩ−２が単独で本抵抗性の主因を果たしているのではなく、アルセリンなどの他の要因とともに関与しているものと考えられた。しかしながら、αＡＩ−２は、αＡＩ−１よりも、多くのマメゾウムシ類の生育を阻害するため、虫害抵抗性の育種素材として有用性が高いと考えられた。

３．イムノスクリーニングにより、αＡＩ−２をコードするｃＤＮＡをクローニングした。得られたクローンは、タンパク質翻訳領域が720bpからなっており、240残基のアミノ酸の配列をコードしていた。また、αＡＩ−２のタンパク質構造とcDNA配列から、αＡＩ−２は、前駆体タンパク質として合成され、シグナルペプチドの除去と内部切断のプロセッシングを受けて成熟化するものと推測された。塩基配列から推定したαＡＩ−２のアミノ酸配列は、αＡＩ−１と75.8％の高い相同性を示した。αＡＩ−１遺伝子を導入したマメ科作物の種子において、αＡＩ−１は、正常にプロセッシングされて阻害活性を示すことが報告されている。このため、αＡＩ−１と類似した構造を持つαＡＩ−２も遺伝子組換えによりマメ科作物で合成させた場合、正常にプロセッシングを受けて阻害活性を発現するものと考えられた。

４．αＡＩの変異の中で、αＡＩ−３は、αＡＩ−１とαＡＩ−２のα−アミラーゼ活性阻害性をあわせもつため、最も有用な生育阻害物質と考えられた。そこで、αＡＩ−３を示すインゲンマメ系統から、αＡＩ−３の単離、精製を試みた。その結果、αＡＩの阻害活性を示す２種類のタンパク質、αＡＩ−３ａとαＡＩ−３ｂが単離され、αＡＩ−３が単一のタンパク質分子種ではないことが明らかになった。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、αＡＩ−３ａのバンドパターンはαＡＩ−１に、αＡＩ−３ｂのバンドパターンはαＡＩ−２に類似していたが、同一ではなかった。しかしながら、Ｎ末端アミノ酸配列を分析した結果、αＡＩ−３ａとαＡＩ−３ｂは２種類の異なるサブユニットから構成され、それぞれ分析した18アミノ酸がαＡＩ−１またはαＡＩ−２とほぼ一致した。αＡＩ−３ａはαＡＩ−１と同様に、ブタすい臓のα−アミラーゼ活性を強く阻害し、ブラジルマメゾウムシ幼虫のα−アミラーゼ活性をほとんど阻害しなかった。また、αＡＩ−３ｂはαＡＩ−２と同様に、ブラジルマメゾウムシ幼虫のα−アミラーゼ活性を強く阻害し、ブタには全く阻害性を示さなかった。以上のように、αＡＩ−３ａはαＡＩ−１に、αＡＩ−３ｂはαＡＩ−２に、それぞれ類似した構造と機能を有する結果を得た。１．の交配試験において、αＡＩ−３は見かけ上、優性の１遺伝子に支配される変異であったため、αＡＩ−３ａとαＡＩ−３ｂは遺伝的に強連鎖関係にあることが示された。αＡＩ−３ａはαＡＩ−１に、αＡＩ−３ｂはαＡＩ−２に、それぞれ類似した遺伝子によりコードされることが推察され、αＡＩ−３は、αＡＩ−１様およびαＡＩ−２様遺伝子の不均等乗換などで生じたと考えられた。